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概论1

1 基因克隆的载体与制备1

1.1 载体与宿主1

1.1.1 常用载体1

1.1.2 宿主细菌11

1.2 质粒DNA的制备15

实验一 大规模制备质粒DNA--碱变性法抽提pBR322质粒DNA15

实验二 氯化铯密度梯度超离心提取pXZ6 DNA23

实验三 小规模制备质粒DNA29

1.3 质粒DNA的鉴定36

实验四 紫外吸收检测DNA的浓度与纯度37

实验五 溴化乙锭--标准DNA浓度比较法测定DNA浓度40

实验六 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA42

实验七 聚炳烯酰胺凝胶电泳检测DNA48

实验八 脉冲电泳检测大分子DNA54

2 目的基因的制备62

2.1 目的基因的来源62

实验九 基因的化学合成63

实验十 基因的PCR扩增技术71

实验十一 逆转录PCR扩增目的基因76

实验十二 DNA的限制性内切酶酶切78

2.2 DNA的酶切78

实验十三 酶切DNA片断的CIP处理86

2.3 DNA酶切片段的分离与回收90

实验十四 从低熔点胶琼脂糖凝胶中分离回收DNA片段90

实验十五 从琼脂糖凝胶中用DEAE插片法回收DNA片断94

实验十六 从琼脂糖凝胶中用QIAEX法和透析袋电泳法分离回收DNA片断96

实验十七 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段101

3 基因克隆与重组DNA的检测107

3.1 DNA的连接与转化107

实验十八 DNA的重组连接107

实验十九 重组DNA的转化113

3.2 重组DNA克隆子的筛选与鉴定121

实验二十 转化子DNA的快速鉴定121

实验二十一 λ噬菌体DNA(分子量Marker)的制备125

实验二十二 重组DNA的快速制备与酶切133

实验二十三 缺口平移法制备32P-DNA探针138

实验二十四 菌落原位杂交149

实验二十五 Southem印迹杂交法156

实验二十六 噬菌体M13mp18克隆目的基因与DNA制备162

实验二十七 噬菌体的点杂交(Dol Blot)167

实验二十八 Nouthern杂交170

实验二十九 DNA的序列测定--单链DNA的序列测定174

实验三十 双链DNA的序列分析180

3.3 寡核苷酸介导的定点突变184

实验三十一 寡聚核苷酸介导的定点突变：缺口双链法184

实验三十二 寡聚核苷酸介导的定点突变：掺U法190

3.4 cCNA文库的构建197

实验三十三 一步法抽提总RNA197

实验三十四 mRNA的分离纯化199

实验三十五 cDNA的合成与分离纯化201

实验三十六 重组λ噬菌体的包装与铺板207

4 表达载体的构建与基因表达213

表达系统的主要条件213

实验三十七 RlRp启动子表达载体表达目的基因215

实验三十八 RLAC启动子表达载体系统表达目的基因217

5 基因工程表达产物的分离纯化与鉴定221

5.1 基因工程表达产物的分离纯化221

实验三十九 凝胶过滤层析技术222

实验四十 离子交换层析技术225

实验四十一 亲和层析技术230

实验四十二 高效液相层析和快速蛋白液相层析(HPLC和FPLC技术)234

实验四十三 大肠杆菌表达基因工程产物的分离纯化238

实验四十四 酵母细胞表达基因工程产物的分离纯化242

实验四十五 CHO细胞表达基因工程产物的分离纯化245

5.2 基因工程产物的分析鉴定246

实验四十六 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)248

实验四十七 免疫酶标技术(ELISA)252

实验四十八 蛋白质印迹分析(Western Blot Analysis)256

实验四十九 蛋白质浓度的测定261

实验五十 蛋白质等电点的测定266

实验五十一 蛋白质N末端氨基酸序列分析272

实验五十二 蛋白质肽谱分析技术276

实验五十三 重组蛋白的生物学活性测定280

6 附录285

6.1 各种试剂的母液配方285

6.2 常用的抗菌素292

6.3 玻璃和塑料器皿的硅化293

6.4 核酸凝胶电泳图谱摄影293

6.5 X-光底片的冲洗方法297

6.6 常用仪器与器皿298

6.7 氨基酸与遗传密码子301

6.8 核酸、蛋白质换算数据303