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目录1

第一篇　组织培养技术1

第一章　绪论和基本理论知识1

第一节　绪论1

一、组织培养发展的回顾1

二、对组织培养工作者的要求和工作方法5

三、组织培养概念6

四、对组织培养的评价7

第二节 培养细胞生物学9

一、生存环境和细胞关系9

二、培养细胞形态学11

三、细胞黏附15

四、培养细胞在体外的生长和增殖过程17

五、培养细胞增殖和分化22

六、组织培养细胞遗传学特征36

七、细胞和细胞、细胞和基质的相互关系38

八、不同细胞生物性状类型38

九、能量代谢39

十、细胞附着底物41

第三节 细胞培养成功率分析42

一、组织和细胞供体年龄42

四、培养方法43

二、培养条件43

三、贴附底物43

第四节 建立细胞系或细胞株44

一、体外培养细胞的种类和命名44

二、建立细胞系（或株）的要求45

三、已建立细胞系或株的鉴定、管理和使用46

第二章　体外培养细胞生存条件、环境和代谢47

第一节 生存环境和条件47

一、无污染环境47

二、温度47

三、生存空间47

四、气体环境和氢离子浓度48

五、体外培养细胞所需基本物质50

六、渗透压56

七、附着底物56

第二节 用于培养的基础液体57

一、水57

二、平衡盐溶液或缓冲液57

第三节 培养用液59

一、人工合成培养基59

二、血清62

三、无血清培养基65

四、其他培养用液72

五、培养用液种类和制备76

第三章　组织培养设施和基本条件79

第一节 实验室设计79

一、设计原则79

二、培养室组成80

第二节 大型设施81

一、净化工作台82

二、无菌操作室82

第三节 实验室设备83

一、电热箱83

三、无菌操作箱83

二、冰箱84

三、显微镜84

四、水纯化装置84

五、洗刷装置85

六、抽滤系统85

七、细胞冷冻贮存器86

八、离心机86

九、天平86

十、加液器装置86

一、玻璃瓶皿87

第四节　培养器皿87

十一、器械87

二、塑料瓶皿88

第四章　培养瓶、皿的清洗和消毒90

第一节　清洗90

一、玻璃瓶皿的清洗90

二、胶塞的清洗93

三、塑料器皿的清洗93

第二节包装93

第三节 消毒94

一、消毒手段94

三、培养用瓶皿、器械等的消毒96

二、对培养液体消毒和保存96

第五章　组织培养基本技术和知识98

第一节　培养前准备98

一、培养操作准备98

二、操作野消毒98

三、洗手和着装99

四、火焰消毒99

第二节　培养基本操作99

一、取材99

二、把组织分离成细胞101

三、细胞计数法109

四、细胞冻存111

五、细胞运送113

第三节 实验工作安全问题113

一、概述113

二、危险事故和防范114

三、发生事故相关性因素的分析115

第六章　组织培养的污染、检测和排除117

第一节 污染途径117

第二节 污染对细胞的影响118

三、支原体污染119

二、细菌污染119

一、真菌污染119

第三节　微生物污染的排除123

一、抗生素除菌法123

二、加温除菌法124

三、动物体内接种除菌法124

四、巨噬细胞吞噬法124

第七章　单层细胞培养技术125

第一节 常规细胞培养方法125

一、天然培养基组织培养法125

二、人工合成培养基组织培养法125

一、二倍体细胞培养法131

第二节 特殊培养法131

二、单细胞分离（克隆）培养132

三、加支持物培养法137

四、球体细胞培养法141

五、悬浮培养法142

第三节 动物组织细胞的培养143

一、鸡胚心肌细胞培养143

二、小鼠胚胎干细胞培养143

三、大鼠骨细胞的分离和培养146

四、家兔关节软骨细胞培养149

一、淋巴细胞培养150

第四节 人体各类组织细胞的培养150

二、利用骨髓培养造血细胞152

三、血管内皮细胞培养155

四、人真皮成纤维细胞培养161

五、脂肪细胞的培养、生长和分化166

六、软骨细胞、肌腱细胞和韧带细胞的分离和培养177

七、人骨成骨细胞的分离和培养182

八、人子宫平滑肌细胞培养188

九、人骨骼肌细胞培养190

十、人乳腺上皮细胞培养192

十一、人毛发外根鞘表皮细胞培养195

十二、人皮肤表皮角质细胞的培养200

十三、胃上皮细胞的培养204

十四、神经组织培养209

第五节 肿瘤细胞培养212

一、肿瘤培养细胞生物学特性212

二、培养方法213

第八章　组织类型培养和三维（三D）培养技术218

第一节 组织类型培养219

一、细胞微球培养219

二、藻酸包被微球和软骨细胞培养221

三、滤槽插入培养224

四、神经组织切片培养227

五、聚集神经细胞培养230

第二节 三维培养技术231

一、干细胞232

二、支架选择240

三、细胞接种和构建CSC方式241

四、三维培养242

第三节 支架（Scaffold）245

一、支架种类245

二、支架材料加工的基本理论和技术纲要251

第四节 三维组织培养组织工程实施范例265

一、在无细胞基质上的复合表皮角质细胞移植物的制备和移植265

二、3D细胞培养乳房再建组织工程271

三、肝细胞三维培养器的发展276

四、膜包被细胞微球280

第五节 三维培养调控理论和措施283

一、概述283

二、细胞增殖和分化284

三、促血管生长291

四、血小板生长因子（PDGF）在创伤修复中的作用295

第九章　组织培养细胞生物学性状检测298

第一节 细胞一般形态学观察法298

一、固定细胞观察法298

二、电子显微镜（电镜）观察法302

二、标本制备及固定304

第二节 免疫细胞化学技术观察细胞成分法304

一、原理304

三、染色方法305

第三节 活细胞直接观察方法309

一、相差观察和摄影309

二、缩时显微摄电影和闭路电视记录311

第四节 培养细胞生物学性状检测311

一、细胞培养常规检查311

二、细胞形态学检测技术312

三、细胞增殖生长方面314

四、培养细胞凋亡（死亡）检测321

五、同工酶（Isoenzyme）检测324

六、抗原标记325

第十章　细胞遗传学性状的检测327

第一节 性染色质检测327

一、原理327

二、方法327

第二节 培养细胞染色体显示法329

一、原理329

二、传代培养细胞染色体显示法330

三、人末梢血微量全血培养染色体显示法332

四、羊水细胞培养333

一、染色体显带334

第三节 染色体结构显示和检测334

二、姐妹染色单体分化染色337

三、染色体脆性位点的检测339

四、微核检测340

第四节 染色体基因定位341

一、细胞原位杂交基因定位原理341

二、荧光标记原位杂交法342

第十一章　组织培养细胞工程技术349

第一节 建立突变细胞系349

一、原理349

二、方法350

第二节 细胞融合352

一、原理353

二、聚乙二醇融合法353

第三节 细胞脱核法355

一、原理355

二、方法356

第四节 细胞同步化（Synehrony）法357

第十二章　体外培养细胞的转化和DNA转导技术360

第一节基本概念和原理360

一、细胞转化与恶变360

二、细胞转化基本过程361

第二节 诱变因素诱发培养细胞转化程序362

一、细胞选择362

二、诱发培养细胞转化364

三、转化细胞的检测365

第三节 几种常用转化细胞和转化技术366

一、致癌化学物转化细胞366

二、病毒转化细胞366

三、癌基因转化细胞368

第四节 基因细胞内导入技术368

一、基因导入的概述368

二、技术方法370

第五节 转基因技术382

二、方法383

一、基本原理383

第十三章　组织培养在生物科学中的应用391

第一节 异生素（Xenobioties）毒性检测概述391

一、利用培养细胞检测毒性概述391

二、基本知识和注意事项395

三、快速检测细胞生存状态395

四、检测细胞生长和增殖397

五、抗癌药检测407

第二节 细胞培养在杂交瘤技术中的应用411

六、医疗和功能性药物检测411

一、原理412

二、杂交瘤细胞的制备414

三、单克隆抗体的大量制备417

第三节 酶联免疫吸附测定（ELISA）技术在抗体检测中的应用418

一、原理418

二、操作流程、类型及特点418

三、实验条件及注意事项420

四、实验室中的几种酶联免疫测定方法及其用途423

一、细胞和基因425

第一节　分子细胞学与基因425

第二篇　分子细胞学技术425

第十四章　分子细胞学基本理论知识425

二、RNA生物学性状431

三、遗传和变异431

第二节 细胞基因工程概要432

一、细胞基因工程原理432

二、培养细胞和细胞基因工程432

三、分子细胞学实验安全知识432

一、细胞培养用设备434

二、分析仪器室434

第一节 基本设备条件434

第十五章　分子细胞学实验室基本设备、技术原理和常规技术操作434

三、离心机室436

四、放射性核素实验室436

五、暗室436

六、洗涤室436

第二节 细胞中大分子的分离、纯化等常规技术437

一、层析分离法437

二、核酸提取法443

三、电泳技术452

四、细菌培养技术461

五、噬菌体的培养、滴定和保存469

第一节 工具酶、质粒和噬菌体472

一、工具酶472

第十六章　细胞基因工程472

二、载体480

三、核素探针标记技术496

四、非放射性标记法508

第二节　DNA分子重组（体外连接）510

一、DNA物理图谱510

二、DNA体外连接513

三、影响连接相关因素520

四、重组子转化和扩增520

第三节 基因克隆523

一、基因组文库法524

二、cDNA文库533

第四节 体外基因（DNA）扩增540

一、PCR原理541

二、PCR反应条件的选定541

三、PCR方法546

四、PCR反应最适条件的选择547

五、PCR产物分析方法547

六、PCR结果及可能的原因547

八、PCR实验操作的注意事项548

九、PCR技术的应用548

七、PCR技术基本特点548

第五节 未知基因的探查551

一、差减cDNA文库法551

二、差异显示法558

第六节 同源重组基因打靶（Targeting）561

一、同源重组纲要561

二、同源重组技术方法566

三、制备纯合突变胚胎干细胞系572

四、试剂和液体575

第一节DNA（基因）探查检测577

一、DNA印迹（Southern Blot）577

第十七章　培养细胞基因性状探查和表达的检测577

二、点迹印迹杂交579

第二节 培养细胞中RNA的检测582

一、甲醛胶电泳分离RNA及Northern Blot的基本原理582

二、方法582

第三节 蛋白质检测584

一、Western Blot584

二、酵母双杂合系统筛选相互作用蛋白587

第四节 基因性状的其他检测方法601

一、基因长度多态性检测601

二、基因遗传变异检测603

一、基本原理604

二、试剂和设备604

第五节　DNA序列分析604

三、实验方法605

四、序列的解读（图17-8）611

第六节 CpG岛甲基化分析612

一、非序列特异性甲基化分析612

二、序列特异性甲基化分析613

三、全基因组序列特异性甲基化分析621

第十八章　基因诊断和治疗技术624

第一节 关于基因诊断和治疗624

第二节 基因诊断和治疗的理论基础624

一、基因结构改变625

二、基因诊断626

三、基因治疗628

附录633

第一部分　相关资料和数据633

一、常用缩写词633

二、重要名词释义637

三、人和动物的一些主要细胞系（或株）644

四、基本单位和数据648

五、核酸数据651

六、遗传密码653

七、氨基酸和蛋白质数据654

八、杂用干液655

九、缓冲液656

十、电泳数据661

十一、酸和碱数据662

十二、常用层析数据663

十三、培养基664

十四、载体669

十五、细菌菌株一览表669

十六、常见大肠杆菌菌株遗传标记671

第二部分 电泳后DNA片段的分析673

第三部分 分子生物学技术入门实验指导675

实验一　测量、微吸和消毒675

实验二　细菌培养技术681

实验三　DNA限制性分析689

实验四　DNA甲基化效应698

实验五　用质粒DNA快速集落转化E.coli702

实验六　质粒DNA的纯化和鉴定708

实验七　抗生素抗性基因重组716

实验八　用重组DNA转化E.coli721

实验九　复制铺板法确认混合的E.coli种群727

实验十　重组DNA的纯化和鉴定729

生物产品供应商介绍739

参考文献742

索引743